小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞是研究血腦屏障（BBB）功能、藥物遞送及神經(jīng)血管疾病的重要模型。然而，由于其分離和培養(yǎng)過程復雜，實驗人員常面臨細胞純度低、存活率差、功能異常等問題。本文總結mBMECs培養(yǎng)中的常見問題，并提出相應的解決策略，以提高實驗成功率。
1.細胞分離困難
問題
mBMECs的分離涉及腦組織消化、密度梯度離心和磁珠分選（如CD31/PECAM-1抗體標記），但常出現(xiàn)細胞得率低或雜質(zhì)細胞（如周細胞、星形膠質(zhì)細胞）污染。
對策
-優(yōu)化消化條件：使用膠原酶/分散酶（Collagenase/Dispase）混合消化（37℃，1–2小時），避免過度消化損傷細胞。
-提高分選效率：采用兩步分選法（如先CD31磁珠分選，再CD45陰性篩選）以去除白細胞污染。
-驗證純度：通過免疫熒光檢測內(nèi)皮標志物（Claudin-5、Glut-1）及污染標志物（α-SMA、GFAP）。
2.細胞貼壁與增殖不良
問題
mBMECs貼壁率低或增殖緩慢，可能與基質(zhì)包被不當、血清質(zhì)量差或培養(yǎng)條件不佳有關。
對策
-基質(zhì)包被優(yōu)化：使用纖維連接蛋白（Fibronectin,10μg/mL）或膠原IV（CollagenIV,50μg/mL）預處理培養(yǎng)皿，促進細胞附著。
-調(diào)整培養(yǎng)基：采用內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基（如EndoGRO-MV或DMEM/F12+20%FBS），并添加生長因子（VEGF、bFGF）。
-控制傳代比例：傳代時保持高密度（1:2或1:3），避免單細胞懸液過度稀釋。
3.細胞形態(tài)與功能異常
問題
培養(yǎng)的mBMECs可能失去典型“鋪路石”形態(tài)，或跨內(nèi)皮電阻（TEER）下降，表明血腦屏障特性退化。
對策
-低氧條件培養(yǎng)：模擬體內(nèi)微環(huán)境（5%CO?+1–3%O?），有助于維持緊密連接蛋白表達。
-共培養(yǎng)模型：與星形膠質(zhì)細胞或周細胞共培養(yǎng)（Transwell體系），可增強屏障功能。
-定期檢測功能指標：通過TEER測量（>200Ω·cm²為佳）及熒光素鈉滲透實驗驗證屏障完整性。
4.微生物污染
問題
由于操作復雜或試劑污染，細胞可能遭遇細菌、真菌或支原體感染。
對策
-嚴格無菌操作：在超凈臺中使用抗生素（如青霉素/鏈霉素），但避免長期使用以防掩蓋污染。
-定期檢測支原體：采用PCR或Hoechst33258染色排查，污染時使用Plasmocin處理。
-分裝試劑：培養(yǎng)基和血清分裝保存，減少反復凍融污染風險。
5.傳代后細胞衰老
問題
高代次（P>5）mBMECs易出現(xiàn)衰老，表現(xiàn)為增殖停滯或形態(tài)扁平化。
對策
-限制傳代次數(shù)：優(yōu)先使用低代次細胞（P3–P5），凍存早期批次備用。
-添加抗衰老因子：如煙酰胺（Nicotinamide）或抗氧化劑（NAC）延緩衰老。
-原代細胞替代：若需長期實驗，考慮使用永生化mBMEC細胞系（如bEnd.3）。
更新時間：2025-07-25
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