一、EPCs的表面標志概述

 

　　EPCs的鑒定依賴于其特異性表面抗原的表達。這些標志物主要包括CD34、VEGFR-2（血管內皮生長因子受體-2，也稱為KDR或Flk-1）和CD133等。然而，EPCs不是單一群體，可分為早期和晚期EPCs，其標志物表達存在動態變化。例如，早期EPCs高表達CD133和CD34，但低表達VEGFR-2；而晚期EPCs則高表達VEGFR-2和vWF（vonWillebrand因子），CD133表達下降。在大鼠模型中，這些標志物與人類和小鼠具有高度同源性，但需注意物種特異性差異。

 

　　二、主要表面標志及其鑒定方法

 

　　1.CD34：CD34是一種跨膜糖蛋白，廣泛表達于造血干細胞和EPCs表面，是EPCs鑒定的基礎標志物。在大鼠骨髓中，CD34陽性細胞通常代表EPCs群體。鑒定時，可采用流式細胞術：首先從大鼠骨髓中分離單個核細胞（通過密度梯度離心法），然后用抗大鼠CD34抗體（如PE或FITC標記）進行染色，通過流式細胞儀分析陽性細胞比例。同時，免疫熒光染色可結合顯微鏡觀察細胞形態。

 

　　2.VEGFR-2(Flk-1)：VEGFR-2是血管內皮細胞的特異性受體，在EPCs中高表達，是區分EPCs與造血干細胞的關鍵標志。在大鼠中，VEGFR-2的檢測可使用抗大鼠Flk-1抗體。通常采用雙標流式細胞術：同時標記CD34和VEGFR-2，CD34+/VEGFR-2+雙陽性細胞被視為EPCs。此外，免疫組化可用于組織切片分析，驗證EPCs在骨髓中的定位。

 

　　3.CD133：CD133是一種早期干/祖細胞標志，在未成熟的EPCs中高表達，但隨著細胞分化而下降。大鼠CD133與人類CD133同源，可用特異性抗體檢測。在流式細胞術中，CD34+/CD133+細胞群體代表早期EPCs；結合VEGFR-2，可進一步提高鑒定準確性。注意，CD133表達可能隨培養時間變化，因此需在分離后盡早檢測。

 

　　4.其他標志物：vWF、CD31和UEA-1（荊豆凝集素-1）等內皮標志物也可用于輔助鑒定。例如，通過免疫熒光雙染色（如CD31與VEGFR-2結合）可確認EPCs的內皮特性。功能實驗如體外成管實驗（Matrigelassay）可驗證這些標志物陽性細胞的血管形成能力。

 

　　三、鑒定流程與注意事項

 

　　鑒定大鼠骨髓EPCs的表面標志通常包括以下步驟：

 

　　-細胞分離：通過穿刺獲取大鼠骨髓，使用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞。

 

　　-細胞培養：在內皮細胞培養基（如EGM-2）中培養，富集EPCs。

 

　　-表面標志檢測：采用流式細胞術或多色免疫熒光進行定量和定性分析。建議使用多標志物組合（如CD34、VEGFR-2和CD133），以避免單一標志物的局限性。

 

　　-功能驗證：通過DiLDL攝取實驗和成管實驗確認EPCs的功能，確保表面標志與生物學行為一致。

 

　　注意事項：

 

　　-物種特異性：大鼠抗體需選擇高特異性試劑，避免交叉反應。

 

　　-動態變化：EPCs的標志物表達隨培養時間和微環境變化，需在多個時間點檢測。

 

　　-純度控制：結合陰性標志（如CD14和CD45）排除單核細胞和造血細胞污染。